Východiskový materiál na izoláciu historickej DNA

Úvod

Vývoj v oblasti výskumu aDNA (ancient DNA – historická DNA) výraznou mierou ovplyvnil nielen objav a aplikácia jednej z najprogresívnejších techník molekulárnej biológie – PCR (polymerázovej reťazovej reakcie), ale aj nových metód na sekvenovanie DNA (napr. NGS – next-generation sequencing). Tým sa vytvoril priestor pre rozvoj ďalších vedných disciplín – molekulárnej antropológie, archeogenetiky, paleogenetiky a pod. Analýza aDNA umožňuje riešiť mnohé problémy evolučnej biológie, napr. skúmať genetickú diverzitu a evolúciu živočíchov a človeka, identifikovať jedincov, determinovať ich pohlavie a detekovať ochorenia u vymretých populácií. Zaujímavé je aj využitie týchto metód pri určovaní pôvodu populácie a príbuzenských vzťahov medzi jedincami v rámci nej, čím sa spresnia údaje o migračných trasách populácií, alebo o histórii skúmanej populácie na základe rozšírenia haploskupín.
Výsledky uvedených analýz sa uchovávajú v databázach, ktoré umožňujú porovnávať genetické charakteristiky vybraných historických populácií. Získané údaje pomôžu vytvoriť presnejší obraz o biologickej charakteristike bývalého obyvateľstva žijúceho na skúmanej lokalite. Každá analýza sa začína izoláciou aDNA z pozostatkov nájdených pri archeologickom výskume.

Zdroje pre izoláciu recentnej DNA

Izolácia DNA je možná z každej bunky obsahujúcej genetický materiál: chromozomálny, mitochondriálny, chloroplastový alebo plazmidový.
Napríklad pri súdnoznaleckej identifikácii osôb sa najčastejšie využívajú ako zdroj DNA leukocyty z krvi, pretože tam je najmenšia možnosť zámernej výmeny, resp. kontaminácie vzorky. Odoberie sa venózna krv a pridá sa antikoagulant. Takto pripravené vzorky je možné pred izoláciou skladovať pri 4 °C niekoľko dní, pri –20 °C niekoľko týždňov a pri –70 °C niekoľko mesiacov. Po rozmrazení je však potrebné krvné vzorky čo najskôr spracovať (do 24 hodín), aby sa predišlo degradácii DNA (Poráčová et al. 2011). Okrem toho je možné použiť aj kvapku krvi fixovanú na FTA papieri. Ide o špeciálne upravený filtračný papier, ktorý umožňuje dlhodobé skladovanie vzorky aj pri izbovej teplote bez poškodenia (Vitha – Yoder 2005). Ďalším zaužívaným spôsobom získania vzoriek je výter z ústnej dutiny. Na výter sa používa špeciálne upravený hrebeň podobný malej zubnej kefke, ktorým sa vytiera ústna sliznica. Na jej povrch sa pritom usadzujú bunky epitelu, ktoré sa odlupujú zo sliznice.
Pri súdnoznaleckej identifikácii sa často vychádza z rôznych vzoriek, ktoré sú dostupné na mieste činu. Podľa charakteru vzorky, resp. nositeľa vzorky DNA závisí aj pravdepodobnosť úspešnej izolácie DNA. S 98 až 100% úspešnosťou môžeme počítať pri vzorkách z výteru ústnej sliznice, čerstvo odobraných krvných vzoriek, a krvných škvrnách na FTA papieri. V praxi sa potvrdilo, že asi 95% úspešnosť môžeme očakávať pri izolácii zo spermií – napr. z použitého kondómu, vytrhnutého vlasu, z krvnej škvrny na odeve, žuvačky alebo zubnej kefky. Asi 60% úspešnosť potvrdzuje vzorky pochádzajúce z kovovej plechovky po limonáde, z elektrického holiaceho strojčeka, z ohorku z cigarety, z obálky či známky prilepenej slinami alebo z čerstvého moču. Ešte s menšou, približne 15% pravdepodobnosťou sa získava DNA z použitej papierovej vreckovky, z vypadnutého vlasu, z krvi v rozklade a zo stolice. DNA nie je možné získať z popola po kremácii (Poráčová et al. 2011).

Zdroje pre izoláciu historickej DNA

Historická DNA podlieha dlhodobo rôznym negatívnym vplyvom prostredia, ktoré spôsobujú jej degradáciu a tiež kontamináciu. Preto sa ako zdroj aDNA môžu použiť iba tkanivá, v ktorých je DNA chránená voči uvedeným faktorom.

Keratínový a chitínový materiál
DNA je spravidla možné úspešne izolovať z keratínových a chitínových materiálov. DNA obsiahnutá v nich je však nižšej kvality, pretože tieto tkanivá podliehajú degradácii v oveľa väčšej miere ako tkanivá s vyšším obsahom anorganických látok.
Medzi keratínové tkanivá patria vlasy, nechty, perie, kopyto či roh, chitínové tkanivá predstavujú väčšinou panciere hmyzu. Vlas pozostáva z troch vrstiev: cortex a medula (obsahujúce keratín) a vonkajšia kutikula. Pri vlasových korienkoch sa nachádzajú tzv. malé živé bunky, ktoré delením a rastom predlžujú vlasové vlákno, pričom sa postupne napĺňajú keratínom. Najväčšie množstvo DNA je práve pri korienkoch, v mieste deliacich sa buniek (Brown–Brown 2011; Campos–Gilbert 2012).
Napriek tomu, že tieto tkanivá obsahujú vo väčšej miere degradovanú DNA (v porovnaní napríklad s kosťami), pri mnohých analýzach sa využívajú ako zdroj DNA, pretože ich odber nie je obtiažny (Campos–Gilbert 2012) a nespôsobuje trvalo viditeľnú deštrukciu poväčšine vzácneho archeologického materiálu.

Koprolity

Zdrojom DNA môžu byť tiež koprolity – skamenelé pozostatky výkalov, ktoré môžeme nájsť väčšinou v jaskyniach alebo v skalných štrbinách. V koprolitoch sa však nezachováva DNA jedinca, od ktorého koprolit pochádza. Analýza DNA obsiahnutej v tomto type historického materiálu sa môže využiť len na výskum zloženia potravy našich predkov alebo zvierat, ak sa v ňom zachovali nestrávené zvyšky potravy – napr. semená v kôstkovici alebo kosti z konzumovaných zvierat atď. (Brown–Brown 2011; Kuch–Poinar 2012).

Vaječné škrupiny

DNA vo vaječných škrupinách sa zachováva v pomerne dobrom stave, pretože je chránená kryštálmi uhličitanu vápenatého obsiahnutými v matrixe škrupiny. Táto ochrana poskytuje tiež bariéru pre exogénnu kontamináciu – výsledky kvantitatívnej PCR dokázali, že vaječná škrupina vtáka moa obsahovala 125 krát menšie množstvo mikrobiálnej DNA (t. j. bola omnoho čistejšia) než kostná vzorka (Oskam et al. 2010). DNA vo vaječnej škrupine sa zachováva niekoľko tisíc rokov a odoláva rôznym klimatickým podmienkam (Oskam–Bunce 2012).

Mäkké tkanivá

Po smrti je organizmus vystavený procesu, pri ktorom nastane degradácia najprv mäkkých tkanív a postupne celého tela (okrem kostí a zubov). Tento proces je zapríčinený chemickými a enzymatickými reakciami v rámci daného organizmu, ako aj pôsobením mikroorganizmov. Pre zachovanie mäkkých tkanív musí byť tento dekompozičný proces eliminovaný. V prirodzených podmienkach to môže nastať pôsobením sucha, veľmi chladného prostredia, anaeróbneho prostredia alebo kalcifikácie.
Najznámejšie príklady na prirodzenú mumifikáciu sú zamrznutí mamuti (najzachovalejšia je z nich Ľuba objavená v roku 2007 na polostrove Jamal) a ľadový muž Ötzi, ktorého našli v roku 1991 v ľadovci Schnalsal v Ötztalerských Alpách blízko hranice Rakúska a Talianska.
Sú známe aj múmie z juhovýchodnej Ázie, ako aj zo strednej Európy (z Brna a z Vác v Maďarsku), zachované vďaka intenzívnemu vysúšaniu. Vysúšanie zabraňuje najmä hydrolytickým reakciám, ktoré najviac poškodzujú DNA.
Múmie budhistických mníchov z juhovýchodnej Ázie boli vytvorené procesom samo-mumifikácie (sokushinbutsu). Uvedený spôsob praktizovali napríklad mnísi z Yamagata v severnom Japonsku, v období medzi 11. a 15. storočím. Budhisti sokushinbutsu nepovažovali za samovraždu ale za formu osvietenia. Proces pozostával z viacerých fáz: mních najprv viedol asketický život, potom konzumoval len bobule, následne len kôru stromov a korene. V ďalšej fáze užíval šťavu stromu Toxicodendron vernicifluum, ktorá dehydratovala a intoxikovala telo, čím ho ochránila pred rozkladom počas procesu vysúšania po smrti (Jeremiah 2010).
Múmie z Vác v Maďarsku boli nájdené v kryptách dominikánskeho rádu, kde v rokoch 1731 – 1838 bolo pochovaných 265 tiel. V kryptách boli podobné klimatické podmienky ako v jaskyniach. Mumifikácii napomohlo aj to, že telá boli pochované v rakvách vyrobených z ihličňanov a vystlané hoblinami. Tieto múmie sa dnes považujú za najlepšie zachované múmie vzniknuté prirodzeným spôsobom, ich koža nie je zvráskavená a tmavá ako u múmií z kapucínskej hrobky v Brne, vzniknutých za podobných podmienok.
Kalcifikované múmie vznikajú dlhodobým pôsobením krasovej vody. Z vody sa kryštalizuje uhličitan vápenatý vo forme mikroskopických kryštálikov, ktoré impregnujú mäkké tkanivá a na povrchu tela vzniká tenká sintrová kôra. Takto sa zachovala napr. aj múmia Zsófie Serédy z Krásnej Hôrky.
Osobitným typom prirodzenej mumifikácie sú tzv. „bog bodies“ („telá z močiarov“). Veľké množstvo takýchto tiel sa zachovalo v severnej časti Európy (v Dánsku, Švédsku, Nemecku, Holandsku, vo Veľkej Británii a v Írsku). V močiari pretrvávajú anaeróbne podmienky a kyslé pH, ktoré môžu zabrániť autolytickým procesom a inhibovať mikrobiálnu činnosť. Kyslosť je zapríčinená veľkým množstvom humínových kyselín, ktoré vznikajú pri rozklade rastlín. Počas zimných mesiacov humínové kyseliny impregnujú telo už pred nástupom mikrobiálnej infekcie, a preto sa zachovávajú mäkké tkanivá oveľa lepšie ako počas teplých letných dní. Najlepšie sa zachovali telá v rašeliniskách, ktoré obsahujú aj rašelinové kyseliny a polysacharidy (sphagnan) s antimikrobiálnym účinkom (Brown–Brown 2011).
Umelá mumifikácia egyptských múmií sa uskutočňovala po odstránení vnútorností dehydratáciou pomocou tzv. nátronu, čo je zmes solí, najmä uhličitanu sodného a hydrogenuhličitanu sodného. Vyznačuje sa zásaditým pH = 9–10, čím sa eliminuje pôsobenie mikroorganizmov (Brown–Brown 2011). Múmie z Egypta však nie sú najstaršie umelo vytvorené múmie. Chinchorro múmie sú mumifikované pozostatky osôb z púšte Atakama v južnej Amerike, ktoré boli mumifikované pôsobením slnka po odstránení vnútorností. Najstaršia múmia z nich sa datuje z roku okolo 7020 pred naším letopočtom, čiže je o 4000 rokov staršia ako prvá egyptská múmia (Arriaza 1995).
Nakoľko sú pri mumifikácii redukované autolytické procesy, DNA je v mumifikovaných tkanivách väčšinou zachovaná v dobrom stave, pričom je samozrejmé, že chladnejšie podmienky sú pre uchovávanie vhodnejšie ako teplé prostredie (Brown–Brown 2011).
Kostné tkanivo
Kostné tkanivo a zuby sú najvhodnejším zdrojom historickej DNA. V porovnaní s mäkkými tkanivami organické štruktúry v kostiach a v zuboch pretrvávajú na pohrebiskách za bežných podmienok, pretože tvrdé tkanivá sa vyznačujú pomerne nízkym obsahom vody a enzýmov, ktoré zapríčiňujú rýchly rozklad tkanív po smrti. Každá kostná bunka (osteocyt) podlieha procesu individuálnej mumifikácie, pretože je chránená pred fyzickým a biochemickým rozkladom mikroorganizmami vďaka svojej polohe v malých komôrkach (lakúnach) obklopených tvrdým anorganickým tkanivom (Höss et al. 1996).
V kostných tkanivách sa DNA viaže na kryštáliky hydroxyapatitu, ktorý ju stabilizuje v kalcifikovanom tkanive, čím spomalí proces jej degradácie. Kolagén predstavuje tiež súčasť komplexného systému, ktorý pomáha zachovávať DNA v kostnom tkanive. Ak hydroxyapatit podlieha degradácii, je postihnutá týmto procesom aj DNA. Čím väčšie sú zmeny hydroxyapatitu a straty kolagénu, tým výraznejšia je aj degradácia DNA. Ak sa DNA nachádza vo vnútri zrastených kostných kryštálikov, je pravdepodobné, že bude zachovaná vo veľmi dobrom stave (Götheströhm et al. 2002, O´Rourke et al. 2000). Zrastené kostné kryštáliky sú odolné voči rozrušeniu aj v prípade použitia chlórnanu sodného počas extrakcie DNA. Použitie uvedeného oxidantu minimalizuje kontamináciu vzorky, pretože spôsobuje degradáciu recentnej DNA, pričom historická DNA ostáva vo vnútri kryštálikov chránená (Salamon et al. 2005).
Boli vyvinuté rôzne metódy na izoláciu DNA z kostných tkanív. Tradične používané metódy na extrakciu DNA (napr. fenol-chloroformova metóda) sú vhodné pri bežných vzorkách, avšak pri vzorkách s čiastočne degradovanou DNA sa osvedčili novšie postupy s využitím rôznych materiálov, ktoré špecificky viažu DNA (silika matrix) alebo naopak nečistoty, resp. inhibítory z roztoku (Chelex 100).

Zuby

Zuby predstavujú v niektorých prípadoch ešte vhodnejší materiál na získanie historickej DNA než kosti. Tkanivo zubov je primárne tvorené z kolagénu a hydroxyapatitu podobne ako u kostí, ale vyznačuje sa štrukturálnou odlišnosťou. Každý zub je zložený z dreňovej dutiny obklopenej dentínom, ktorý sa skladá zo skloviny a cementu umiestneného v čeľusti. Dreňová dutina obsahuje živé bunky, krvné cievy a nervy, pomocou ktorých je na konci koreňa spojená s mäkkými tkanivami čeľuste. Mäkké tkanivá a zubná dreň po smrti rýchlo degradujú. Ďalšie zložky (sklovina a cement) obsahujúce kolagén a minerálne látky sú však vo väčšej miere rezistentné na postmortálne poškodenie. Vnútorné časti zubov sú chránené pred kontamináciou recentnou DNA vďaka sklovine, ktorá oproti kostiam nemá pórovitý povrch, pretože je zastúpená iba minerálnou látkou hydroxyapatitom (Brown–Brown 2011).
Vzorky zubov pre analýzu DNA by mali byť bez kazov, pretože cez zubný kaz môže preniknúť kontaminácia do dreňovej dutiny. Použitie napríklad neprerezaného zuba ďalej znižuje uvedené riziko (O´Rourke et al. 2000).

Záver

Zdroje DNA, ktoré sa bežne využívajú pri analýzach recentného materiálu (krv, sliny a pod.) nie je možné použiť v archeogenetickom a paleogenetickom výskume. Pre úspešnú analýzu sa musí hľadať materiál, ktorý obsahuje DNA chránenú anorganickou zložkou voči negatívnym vplyvom prostredia. Ako východiskový materiál pre získanie DNA sa môžu využiť predovšetkým kalcifikované tkanivá. Ďalšou látkou stabilizujúcou DNA môže byť kolagén. Proces rozkladu môže byť pozastavený aj pôsobením sucha, veľmi chladného alebo anaeróbneho prostredia. Ako východiskový materiál pre archeogenetický výskum nám preto môžu slúžiť predovšetkým zuby a kompaktné kostné tkanivo. V špeciálnych prípadoch môžu byť vhodné aj mäkké tkanivá, keratinizované útvary (perie, vlasy) či vajcové škrupiny a koprolity.

Publikácia vznikla v rámci projektu VEGA č. 1/0897/12 „Archeogenetický výskum kontaktnej zóny z 10. storočia na Slovensku“, v rámci ktorej spolupracuje Katedra botaniky a genetiky Fakulty prírodných vied Univerzity Konštantína Filozofa v Nitre, Katedra biológie Pedagogickej fakulty Univerzity J. Selyeho v Komárne, Archeologický ústav Slovenskej akadémie vied v Nitre a Laboratórium archeogenetiky Archeologického ústavu Výskumného centra humanitných vied Maďarskej akadémie vied v Budapešti.

Literatúra

Arriaza, B. T.
1995 Beyond Death. The Chinchorro Mummies of Ancient Chile. Washington: Smithsonian Inst Press.

Brown, T. – Brown, K.
2011 Biomolecular archaeology an introduction. 1th ed. Chichester: Wiley-Blackwell.

Campos, P. F – Gilbert, T. M. P.
2012 DNA Extraction from Keratin and Chitin. In Ancient DNA, Methods and Protocols. New York: Springer.

Götheström, A. – Collins, M. J. – Angebjörn, A. – Lidén, K.
2002 Bone preservation and DNA amplification. Archaeometry 44, s. 395–404.

Höss, M. – Jaruga, P. – Zastawny, T. – Dizdaroglu, M. – Pääbo, S.
1996 DNA demage and DNA sequence retrieval from ancient tissues. Nucleic Acids Research 24, s. 1304–1307.

Jeremiah, K.
2010 Living Buddhas: the self-mummified monks of Yamagata, Japan. McFarland & Company, Inc., Publishers Jefferson, North Carolina, and London.

Kuch, M. – Poinar, H.
2012 Extraction of DNA from Paleofeces. In Ancient DNA, Methods and Protocols. New York: Springer.

Mullis, K. B. – Faloona, F. A.
1987 Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155, s. 335–350.

O’Rourke, D. H. – Hayes, M. G. – Carlyle, S.W.
2000 Ancient DNA Studies in Physical Anthropology. Annual Review of Anthropology 29, s. 217–242.

Oskam, C. L. – Haile, J. – McLay, E et al.
2010 Fossil avian eggshell preserves ancient DNA. Proc. Biol. Sci. 277, s. 1991–2000.

Oskam, C. l. – Bunce, M.
2012 DNA Extraction from Fossil Eggshell. In Ancient DNA, Methods and Protocols. New York: Springer.
Poráčová, J. – Nagy, M. – Zahatňanská, M. et al.
2011 Biometria živočíchov a človeka. Prešovská univerzita v prešove, FHPV, Univerzita J. Selyeho v Komárne, PF, Centrum excelentnosti ekológie, živočíchov a človeka, PU v Prešove, Prešov.

Saiki, R. – Schvarc, S. – Faloona, F. et all.
1985 Enzymatic amplification of â-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, s. 1350–1354.

Saiki, R. K. – Gelfald, D. H. – Stoffel, S. – Scharf, S. – Higuchi, R., et al.
1988 Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, s. 487–491.

Salamon, M. – Tuross, N. – Arensburg, B. – Weiner, S.
2005 Relatively well preserved DNA is present in the crystal aggregates of fossil bones. PNAS 102, s. 13783–13788.

Vitha, S. – Yoder, D. W.
2005 High Throughput Processing of DNA Samples on FTA Paper for PCR Analysis. [online] Texas A and M University, http://microscopy.tamu.edu/lab-protocols/protocols-FTA_paper_processing.pdf [cit. 2011-11-3]

Source materials for the isolation of ancient DNA
(Summary)

Blood and saliva which are preferably used in the analysis of recent samples are out of the question in archaic remains because their genetic materials decompose by autolytic processes immediately after the death. For the successful analysis must find material that contains the DNA protected with inorganic components from negative effects of the environment. As a source material for obtaining DNA can be used in particular calcified tissues. Another stabilizing agent of DNA may be the collagen. Decomposition process can be suspended with the effects of drought, cold or anaerobic environment. As a source material for archaeogenetic research may serve primarily teeth and compact bone tissue. In special cases may be appropriate soft tissue, keratinized formations (feathers, hair), or egg shells and coprolites too.

Alapanyagok az archaikus DNS izolálásához
(Összefoglalás)

Az archaikus DNS izolálása lehetővé teszi a minták genetikai elemzését. A recens minták analízisénél előnyben részesített DNS-alapanyagok (vér, nyál) azonban nem alkalmasak az archeogenetikai és paleogenetikai kutatásokra, hiszen a bennük található genetikai anyag a halál beállta után autolitikus folyamatoknak van kitéve. A sikeres analízis érdekében olyan mintákat kell keresni, melyek a környezet negatív hatása által nem károsított DNS-t tartalmaznak. Elsősorban a kalcifikált szöveteket tudjuk alapanyagként felhasználni, de a kollagén is stabilizálhatja a DNS-t. A bomlási folyamatokat leállíthatja továbbá a szárazság, az alacsony hőmérséklet, és az anaerób környezet is. Az archeogenetikai kutatások alapanyagaként a fogak és a csontok a legmegfelelőbbek. Speciális esetekben alkalmasak lehetnek a lágy szövetek, a szaruanyagok (toll, haj), a tojáshéj vagy a koprolitok is.